非變性裂解液（細(xì)胞樣品）
|
貨號(hào)
|
產(chǎn)品名稱
|
規(guī)格
|
|
RL1080
|
非變性裂解液（細(xì)胞樣品）
|
100 ml
|
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
非變性裂解液（細(xì)胞樣品）（Native Lysis Buffer for
Cells）是一種用于活性提取哺乳動(dòng)物細(xì)胞的胞漿蛋白、胞核蛋白的提取試劑。本產(chǎn)品與Thermo的M-PER® Mammalian Protein Extraction Reagent（Thermo貨號(hào)：78501，78503，78505）以及Sigma的CelLytic M mammalian cell
lysis/extraction reagent（Sigma貨號(hào)：C2978）為同類產(chǎn)品，可以考慮平替。
本產(chǎn)品含有一種比較溫和的非變性去垢劑，緩沖系統(tǒng)pH7.6，能夠確保蛋白高效抽提的同時(shí)還可以保留蛋白樣品中蛋白或酶的活性，便于進(jìn)行后續(xù)的蛋白活性分析檢測(cè)。
對(duì)于使用本產(chǎn)品提取的蛋白溶液，如果希望去除其中的去垢劑，可以通過(guò)離心式去垢劑去除柱（貨號(hào)：DD0550）快速去除。
本產(chǎn)品提取的蛋白樣品，能較好地保持其原有的空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性，可用于蛋白的非變性電泳和多種生物化學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)用途。例如，Tris-甘氨酸非變性電泳（貨號(hào)：RTD6135，RTD6130）、Blue Native電泳（貨號(hào)：RTD6139，RTD6140）、免疫沉淀(IP)、免疫共沉淀(Co-IP)，ELISA等常規(guī)生化分析，luciferase、β-gal、alkaline
phosphatase、chloramphenicol
acetyltransferase (CAT)等報(bào)告基因(Report
gene)酶活性檢測(cè)，PKA、PKC和酪氨酸激酶等蛋白激酶活力的檢測(cè)，以及帶有HA、Flag、Myc、V5、His和GST等標(biāo)簽蛋白的分離純化等方面的用途。
使用本產(chǎn)品獲得的蛋白樣品可用BCA 蛋白濃度測(cè)定試劑盒(貨號(hào)：RTP7102)或Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（去垢劑兼容型）（貨號(hào)：RTP7104）進(jìn)行定量分析。由于含有較高濃度去垢劑，不建議使用Bradford蛋白濃度測(cè)定試劑盒（貨號(hào)：RTP7101）測(cè)定蛋白含量。
本產(chǎn)品裂解液比較溫和，對(duì)于膜蛋白提取效果不好，不建議用于膜蛋白提取；由于組織的特殊性，本產(chǎn)品不建議用于組織蛋白的非變性提取。
按照每次裂解5×106細(xì)胞，每次使用0.5 ml裂解液，該產(chǎn)品可以提取200個(gè)樣品。
● 產(chǎn)品特點(diǎn)：
1. 高效：提取效率比凍融、超聲等方法效率高。
2. 非變性：最大限度保持蛋白活性，不會(huì)干擾下游應(yīng)用。
3. 方便：貼壁細(xì)胞可以直接在器皿上裂解，不用刮下細(xì)胞。
4. 快速：可在常溫下快速裂解細(xì)胞。
● 保存、運(yùn)輸及效期：
4度保存，常溫運(yùn)輸，有效期兩年。
● 用前必讀：
1. 裂解樣品的所有步驟都需在冰上或4℃進(jìn)行。
2. 需自備蛋白酶抑制劑或者購(gòu)買蛋白酶抑制劑Cocktail (不含EDTA，片劑，通用型)（貨號(hào)：PC2930）和/或磷酸酶抑制劑。
● 使用說(shuō)明：
1. 準(zhǔn)備即用型裂解緩沖液：
向預(yù)冷的裂解緩沖液中加入蛋白酶抑制劑（自備，貨號(hào)：PC2930）；如果進(jìn)行磷酸化研究，還需要加入磷酸酶抑制劑（自備），混勻，冰上預(yù)冷待用。
2. 貼壁細(xì)胞總蛋白提?。?/b>
2.1 去除培養(yǎng)液，加入適量1×PBS，輕柔漂洗一遍，不要擾動(dòng)貼壁細(xì)胞。按照下表直接在培養(yǎng)器皿中加入裂解液，移液器吹打數(shù)下，使裂解液和細(xì)胞充分接觸，冰上裂解細(xì)胞5分鐘，間歇混勻。
|
培養(yǎng)板規(guī)格/培養(yǎng)皿表面積
|
細(xì)胞量
|
裂解液推薦使用量
|
|
100 mm培養(yǎng)皿*
|
~1.5×107
|
0.5-1 ml
|
|
60 mm培養(yǎng)皿
|
~5×106
|
0.25-0.5 ml
|
|
35 mm培養(yǎng)皿
|
~2×106
|
0.2-0.4 ml
|
|
6孔板
|
~2.5×106
|
200-400 μl
|
|
24孔板
|
~5×105
|
100-150 μl
|
|
96孔板
|
~1×105
|
50-100 μl
|
注：100 mm培養(yǎng)皿收集的細(xì)胞量~1.5×107（50 mg），可以提取~3 mg總蛋白。
2.2 細(xì)胞收集于1.5 ml離心管中，冰上繼續(xù)裂解15分鐘，間歇混勻。
2.3 4℃ 16000 g離心10分鐘，取上清。
3. 懸浮細(xì)胞總蛋白提?。?/b>
3.1 450 g 4℃ 離心5 min收集細(xì)胞；用適量1×PBS重懸細(xì)胞，450 g 4℃ 離心5 min收集細(xì)胞；重復(fù)漂洗細(xì)胞一次；
3.2 按照細(xì)胞沉淀體積（PCM）20 μl（~20 mg）加入200 μl 裂解緩沖液的比例加入裂解液，混勻細(xì)胞沉淀，冰浴處理15分鐘，間歇混勻。
注：2×106 Jurkat細(xì)胞，其細(xì)胞沉淀體積（PCM，Packed Cell Volume）大約為20 μl（~20 mg），可以提取~1.5 mg總蛋白。
3.3 4℃ 16000 g離心10分鐘，取上清。
4. 可選步驟：蛋白樣品去除去垢劑：
如果實(shí)驗(yàn)中遇到以下情況，建議進(jìn)行步驟4。非變性電泳，發(fā)現(xiàn)樣品中的去垢劑導(dǎo)致泳道拖尾；樣品中的去垢劑影響后續(xù)實(shí)驗(yàn)，如ELISA或酶活性測(cè)定；樣品中的去垢劑對(duì)質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)有影響。
4.1去垢劑去除柱（自備，貨號(hào)：DD0550）預(yù)處理：
4.1.1 取出柱子，放入套管中。
4.1.2 旋開(kāi)管蓋，不要擰掉柱子底部堵頭，加入0.4 ml 1×PBS，蓋緊管蓋，常溫靜置2 min，活化填料。
4.1.3 擰掉柱子底部堵頭，將柱子放入套管中，1000 g 離心1
min，棄流穿液。
注：離心力不要高于1000 g，過(guò)高的離心力會(huì)損傷填料，降低去垢劑去除效率。
4.1.4在柱子管蓋上標(biāo)記填料在柱子內(nèi)的傾斜方向，隨后離心步驟均按同一傾斜方向在離心機(jī)內(nèi)放置柱子。
4.1.5柱子中加入0.4 ml 1×PBS，1000 g 離心1min，棄流穿液。至此，柱子活化結(jié)束，備用。
4.2 樣品去垢劑去除：
4.2.1 將柱子轉(zhuǎn)移到2 ml尖底離心管中，加入25-100 μl待處理樣品（樣品濃度高于0.5 μg/μl），常溫靜置2 min。
4.2.2 1000g 離心2 min，收集離心管內(nèi)樣品。
5. 常見(jiàn)問(wèn)題：
|
常見(jiàn)問(wèn)題
|
可能原因
|
解決方法
|
|
蛋白提取得率低
|
RL1080未能有效裂解細(xì)胞膜
|
步驟2.2和3.2修改為4度條件下?lián)u床持續(xù)混勻30min。
|
|
RL1080使用量不夠
|
加入更多的裂解液
|
|
蛋白表達(dá)量低
|
優(yōu)化轉(zhuǎn)染程序
|
|
不能提取膜蛋白
|
RL1080非變性裂解液僅能提取胞漿蛋白和胞核蛋白
|
使用膜蛋白提取專用裂解緩沖液
|
● 實(shí)驗(yàn)示例：
實(shí)驗(yàn)程序：
樣品提?。篕562細(xì)胞 1×107細(xì)胞，400 g 離心3 min收集，1×PBS清洗2次，細(xì)胞沉淀中加入0.6 ml
非變性裂解液（貨號(hào)：RL1080），輕柔懸浮細(xì)胞，4度冰浴15min，間歇混勻，
4度 16000 g 15 min，收集上清。
電泳上樣樣品制備：BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒測(cè)定濃度（貨號(hào)：RTP7102），
樣品加入4×BN/CN-PAGE蛋白上樣緩沖液（貨號(hào)：PL114 ），調(diào)配為0.3 μg/μl上樣液，
上樣40 μl（12 μg）。
樣品1：RL1080提取樣品，加終濃度0.125% G-250（5% G-250染料，貨號(hào)：BC260）；
樣品2：RL1080提取樣品，不加G-250；
樣品3：RL1080提取樣品使用離心式去垢劑去除柱（貨號(hào)：DD0550）去除去垢劑，
樣品4：柱式動(dòng)物胞漿蛋白提取試劑盒(細(xì)胞樣品,非變性提取,不含去垢劑)（貨號(hào):RTD8106）提取樣品；
凝膠制備：Blue/Clear 非變性凝膠電泳試劑盒（手灌膠）（貨號(hào)：RTD6140）
制備10% 厚度1.5 mm凝膠；
電泳：使用10×BN電泳緩沖液（貨號(hào)：BC500P）。開(kāi)始電泳用1×藍(lán)色BN電泳緩沖液（0.02%G250），
恒壓200 V 51min后，換無(wú)色1×BN 電泳緩沖液,電泳時(shí)間共104 min
凝膠預(yù)處理：凝膠浸泡于1×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液+0.1%SDS中 搖床慢搖10 min
濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜：用10×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液（貨號(hào)：BC600P）配制1×BN轉(zhuǎn)膜緩沖液+20%甲醇，用0.45 μm
PVDF，恒流200 mA（電壓變化114-83 V） 2小時(shí)，未冰?。ň彌_液水溫36度）。膜用無(wú)水甲醇去除藍(lán)色
封閉：Western快速封閉液（貨號(hào)：WR5020）快速封閉 10 min
GAPDH檢測(cè)：GAPDH 兔單抗（貨號(hào)：RGA1150） 1:10000 過(guò)夜孵育；
羊抗兔IgG-HRP 1:5000（貨號(hào)：HGR1020） RT 1h，ECL 1秒
抗體清除：PVDF膜用Western一抗二抗去除液（弱堿，溫和型）（貨號(hào)：WS1200） 清除30min，
Western快速封閉液（貨號(hào)：WR5020）快速封閉 10min。
Lamin B1檢測(cè)：Anti-Lamin B1抗體（兔單抗）（貨號(hào)：RGL1150）1：3000 RT 1h，
羊抗兔IgG-HRP 1:5000（貨號(hào)：HGR1020） RT 1h，ECL 8秒