2×ligation solution MasterMix
2×DNA連接緩沖液
● 產(chǎn)品組成：
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貨號
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名稱
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規(guī)格
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RTV701
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2×ligation solution MasterMix
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150 μl
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注；按照10μl連接體系計算，每次使用5μl，可以使用30次。
● 保存：-20℃
● 產(chǎn)品簡介：
2×ligation solution MasterMix是含有T4 DNA Ligase，ligation buffer的2×MasterMix，實驗時，只需加入片段和載體即可進行連接反應(yīng)。
適用于DNA片段和載體DNA的連接以及DNA片段和Linker或Adaptor DNA的連接。
● 注意事項
1．2×ligation solution MasterMix由于含有T4 DNA ligase，使用前冰浴中徹底融化，混勻后使用。
2．為了提高轉(zhuǎn)化效率，轉(zhuǎn)化時建議所加入連接產(chǎn)物的量不要超過感受態(tài)細胞體積的10%。
● 使用方法：
一 DNA片段和載體DNA的連接
1）粘性末端的連接
1．反應(yīng)體系:
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10μl體系
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終濃度
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線性載體DNA
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：載體=1:1-5:1*
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：載體與插入片段的摩爾數(shù)比需要優(yōu)化：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可得到較好的結(jié)果。用以下公式計算片段摩爾數(shù)：pmol數(shù)= DNA量(ng)/(660×片段bp數(shù))×1000。例如：插入片段2000bp，線性載體為3000bp，如果載體使用量為50ng（0.025pmol），10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數(shù)為0.075pmol，插入片段2000bp的使用量為100ng。
2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5 μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細胞或取1-2 μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細胞。
注：1）若要提高電轉(zhuǎn)實驗效率，推薦65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒或氯仿抽提對連接后的DNA片段進行純化后進行電擊轉(zhuǎn)化。
2）若要提高轉(zhuǎn)化子數(shù)目，可將連接時間延長至1小時。
2）平末端的連接
1．反應(yīng)體系:
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10μl體系
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終濃度
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線性平末端載體DNA*
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x μl
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10-50 ng
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插入DNA片段
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y μl
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插入片段：載體=1:1-5:1**
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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*：平滑末端的載體與 DNA 片段進行連接時，應(yīng)首先將載體進行去磷酸化處理，以防止其自身環(huán)化。
**：載體與插入片段的摩爾數(shù)比需要優(yōu)化：一般vector:insert在1:1~1:5之間均可得到較好的結(jié)果。用以下公式計算片段摩爾數(shù)：pmol數(shù)= DNA量(ng)/(660×片段bp數(shù))×1000。例如：插入片段2000bp，線性載體為3000bp，如果載體使用量為50ng（0.025pmol），10μl連接體系中vector:insert的摩爾比是1:3，則需要2000bp pmol數(shù)為0.075pmol，插入片段2000bp的使用量為100ng。
2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5 μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細胞或取1-2 μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細胞。
注：1）若要提高電轉(zhuǎn)實驗效率，推薦65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘以滅活T4 DNA Ligase后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒或氯仿抽提對連接后的DNA片段進行純化后才能進行電擊轉(zhuǎn)化。
2）若要提高轉(zhuǎn)化子數(shù)目，可將連接時間延長至1小時。
二 線性DNA的自身環(huán)化
1．反應(yīng)體系:
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10μl體系
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終濃度
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線性載體DNA
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x μl
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10-50 ng
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．可取5 μl連接產(chǎn)物熱擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細胞或取1-2 μl連接產(chǎn)物電擊轉(zhuǎn)化50 μl感受態(tài)細胞。
注：1）若要提高電轉(zhuǎn)實驗效率，推薦65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘滅活T4 DNA Ligase后，用DNA產(chǎn)物純化試劑盒或氯仿抽提對連接后的DNA片段進行純化后才能進行電擊轉(zhuǎn)化。
三 接頭連接
1．反應(yīng)體系:
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10μl體系
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終濃度
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線性DNA
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x μl
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100-300 ng
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磷酸化接頭
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y μl
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0.5-1 μg
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2×ligation solution MasterMix
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5 μl
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1×
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ddH2O
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up to 10 μl
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2．徹底輕柔混勻后，瞬間離心，將管壁上的溶液收集到管底。
3．反應(yīng)條件：16℃孵育30分鐘。
4．65℃孵育10分鐘或70℃孵育5分鐘滅活T4 DNA Ligase。連接產(chǎn)物可以直接進行限制性內(nèi)切酶酶切反應(yīng)。